在ELISA实验里，样品稀释是极为关键的步骤，它会对实验结果产生重大影响。一般产品的样品稀释倍数都是通过大量试验确定的，这样做是为了保证试验的灵敏度和特异性。酶联免疫反应具有很高的敏感性，如果血清不进行稀释，不可避免地会产生很强的非特异性反应，进而出现假阳性结果。
以一项针对某种疾病抗体检测的ELISA实验为例，科研人员最初未对血清样品进行稀释，结果检测结果显示大量样本呈阳性。然而，后续通过其他更精确的检测方法进行验证，发现其中很大一部分实际上为阴性。这就是因为血清未稀释，导致非特异性反应过强，产生了假阳性。所以，严格按照产品规定的稀释倍数进行样品稀释，是确保ELISA实验准确性的重要前提。
ELISA实验中，所有试剂和板条都应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20 - 30分钟以上。平衡时间如果太短，会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，导致ELISA反应不够充分。
在冬季，由于室温较低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。曾经有实验室在冬季进行ELISA实验时，未对试剂盒进行充分平衡，直接开始实验。结果发现，同一批次的样品检测结果差异很大，部分孔的显色非常浅。经过排查，发现是试剂盒未平衡至室温，试剂反应不充分所致。之后，他们按照要求将试剂盒平衡至室温后再进行实验，结果的稳定性和准确性得到了显著提高。
无论是稀释前还是稀释后的样品，都必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，这样才能保证试验的均一性。如果样品和试剂混匀不充分，会导致同一批次不同孔之间的反应不一致，从而影响实验结果的准确性。
例如，在某实验室进行的细胞因子检测ELISA实验中，实验人员在加样时没有将样品充分混匀。结果在检测后发现，同一细胞培养上清液的不同加样孔之间，检测值差异很大。经过分析，确定是样品混匀不充分导致的。后来，实验人员在加样前对样品进行了充分的涡旋振荡混匀，再次进行实验，孔间差异明显减小，实验结果更加可靠。
加样是ELISA实验中一项非常重要的步骤，操作不当会引发诸多问题。加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性；加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。
有一次，某科研团队在进行药物浓度检测的ELISA实验时，由于加样速度过快，部分样品溅到了孔壁上。结果在检测过程中，这些溅到孔壁上的样品发生了非特异吸附，导致检测结果出现偏差。另外，如果加样时产生气泡，气泡会占据一定的空间，影响样品和试剂的反应，也会使检测结果不准确。所以，在加样时要缓慢、准确地将样品加入到孔的底部中央，避免上述问题的发生。
温育过程中可能出现的问题会直接影响ELISA实验的结果。温育的时间或温度不够，会导致结果非常弱。例如，在一些病毒抗体检测的ELISA实验中，如果温育时间不足，抗原 - 抗体反应不完全，显色就会很浅，检测结果可能会出现假阴性。
曾经有实验室在进行一项传染病抗体筛查的ELISA实验时，温育箱的温度出现了偏差，实际温度比设定温度低了几度。结果导致整个实验的显色都很弱，很多原本阳性的样本检测结果呈阴性。经过校正温育箱温度后，重新进行实验，才得到了准确的结果。所以，要定期对温育箱的温度进行校准，确保温育时间和温度符合实验要求。
ELISA试验的稳定性和重复性是衡量实验质量的重要指标。但在实际操作中，常常会出现结果重复性不好的情况，即相同的材料和相同的操作方法做出的结果截然不同。
造成标准曲线和测定重复性差的原因有很多，包括加样本及试剂量不准、孔间不一致、加样过快导致孔间发生污染、加错样本、加样本及试剂时加在孔壁上部非包被区、不同批号试剂盒中组分混用、温育时间、洗板、显色时间不一致、孔内污染杂物、酶标仪滤光片不正确、试剂/样品没有混匀、血清标本未完全凝固即加入等。
例如，某实验室在进行肿瘤标志物检测的ELISA实验时，发现不同批次的实验结果差异很大。经过仔细排查，发现是由于不同批号试剂盒中组分混用导致的。不同批号的试剂盒在生产过程中可能存在一定的差异，如果混用，会影响实验的重复性。另外，洗板不充分也是导致重复性差的常见原因之一。在一项细胞因子检测实验中，实验人员重复使用封板胶纸，导致HRP残留污染，使得板内和板间的重复性都很差。后来，每步均更换使用新的封板胶纸，问题得到了解决。所以，在实验过程中要严格按照操作规程进行，尽量减少人为因素对实验结果重复性的影响。