（一）原料要求

1. 抗原：纯度≥95%（SDS-PAGE验证），浓度≥1mg/mL，无杂蛋白污染；

2. 抗体：多克隆抗体效价≥1:10000，单克隆抗体特异性达标（交叉反应率≤5%）；

3. 酶标记物：HRP标记抗体，标记率1-5，比活性≥10U/mg；

4. 辅料：包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）、洗涤液（PBS+0.05%吐温20）、封闭液（5%脱脂奶粉）、TMB底物液、2mol/L硫酸终止液；

5. 载体：96孔聚苯乙烯酶标板（高吸附型，批内CV≤5%）。

（二）关键设备

- 高精度移液器（10μL、100μL、1000μL）、酶标仪（波长450nm）、低温离心机（10000r/min）；

- 恒温孵育箱（精度±0.5℃）、超净工作台、透析袋（截留分子量10kDa）、自动洗板机。

（三）操作步骤（按流程执行）

1. 原料预处理与筛选

1. 抗原纯化：采用亲和层析法纯化抗原，收集洗脱峰，透析至PBS缓冲液（pH7.4），BCA法测定浓度，-20℃分装保存；

2. 抗体筛选：用棋盘滴定法确定抗体最佳包被浓度（1-10μg/mL），确保与抗原结合OD值≥1.0，阴性对照OD值≤0.1；

3. 酶标记物验证：检测标记物的酶活性，确保经稀释后与抗原反应的OD值在0.8-1.5之间，无游离酶残留。

2. 酶标板包被与封闭

1. 包被液配制：准确称量Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH至9.6；

2. 抗原稀释：用包被缓冲液将抗原稀释至最佳浓度，每孔加100μL，避免气泡产生；

3. 孵育：4℃恒温孵育12-16小时，期间每隔2小时轻摇酶标板1次，确保抗原均匀吸附；

4. 洗板：弃去包被液，自动洗板机洗板5次，每次浸泡30秒，洗后倒置拍干；

5. 封闭：每孔加200μL封闭液，37℃孵育1.5小时，洗板5次后拍干，密封后4℃保存备用（72小时内使用）。

3. 反应试剂配制

1. 洗涤液：PBS缓冲液（pH7.4）中加入吐温20至终浓度0.05%，现配现用；

2. 样品稀释液：含1%BSA、0.05%吐温20的PBS缓冲液，过滤除菌后4℃保存；

3. 酶标记物稀释：用样品稀释液将HRP标记抗体按1:5000-1:10000比例稀释，现配现用；

4. 底物液：A液（TMB溶液）与B液（过氧化脲溶液）按1:1体积混合，避光保存（配制后1小时内使用）；

5. 终止液：缓慢加入浓硫酸至蒸馏水中，配制2mol/L硫酸溶液，室温避光保存。

4. 标准品与对照制备

1. 标准品：将已知浓度的抗原用样品稀释液梯度稀释为6个浓度点（如0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL），-20℃分装；

2. 阴性对照：无目标抗原的样品稀释液；阳性对照：含目标抗原的标准品溶液（浓度5ng/mL）。

5. 试剂盒组装

       酶标板1块

       真空密封袋1个

       封板膜2张

       酶标记物1瓶底物液A/B各1瓶

       终止液1瓶

       标准品6管

       检测抗体-HRP

       样本稀释液

       20X洗剂缓冲液

注： 所有试剂标注批号、有效期，酶标板及说明书密封后放入包装盒内，试剂盒外包装标注产品名称、批号、储存条件（2~8℃避光）、有效期6个月。